脑部神经学突破性采样技术！OFM开放式微灌流技术小分子采样适用性研究

测定啮齿类动物脑组织间液（ISF）中的物质浓度，是脑活性药物研发过程中的一个核心环节。目前脑活性药物及候选药物许多为小分子亲脂性化合物，其具备穿越血脑屏障（BBB）的能力。现有多种方法可用于评估脑组织ISF中此类物质的浓度，其中非侵入性方法通常分辨率有限，而活检法则往往特异性不足。微透析（MD）与脑部开放式微灌流（cOFM）技术属于侵入性方法，其重要优势在于能够提供时间分辨数据，从而实现对脑组织动态过程的精准测量，这一特点使其在脑部药代动力学研究中大显身手。

MD采样技术能够直接从目标组织的ISF中获取游离药物浓度或内源性物质浓度的数据，并具备足够的空间分辨率。然而，在使用MD采样期间，BBB的完整性状态仍存在较大不确定性。除此之外，亲脂性物质采样时，易吸附于MD膜上，不仅限制了跨膜交换效率，还导致所获样本中物质浓度显著偏低，对高亲脂性分析物产生明显的过滤效应。

脑部开放式微灌流（cOFM）是一种基于推-拉式灌注原理的采样装置，其探针表面化学惰性、光滑，以及无膜设计的特性，可最大限度地减少非特异性吸附。与仅能采集ISF游离药物的MD法不同，cOFM采集的ISF中还包含蛋白质及其结合药物，这对药效学结果具有显著影响。cOFM能对ISF中的亲水性和亲脂性物质进行时间分辨式的采样。有研究表明，在cOFM探针植入14天后，其采样区域的BBB完整性即可恢复。

本研究旨在比较脑部开放式微灌流（cOFM）与MD两种方法在采样ISF中亲脂性物质阿米替林（AMI）、其代谢产物（HYA、NOR、ANO）、氘代水（D₂O）以及BBB渗透性亲水性标记物荧光素钠（Naf）的适用性。本研究中采用了一种经过优化的cOFM系统，其探针外径更小，从而提高了空间分辨率并减少了植入创伤。此外，对开放式交换区域的重新设计也显著提升了cOFM的整体性能。通过探针样本的体内药时曲线下面积比值（AUC_OFM/AUC_MD）和D₂O的体内相对回收率（RR_vv,D₂O）对两种方法的性能进行评估。在开展体内实验前，通过体外相对回收率（RR_vt）评估了AMI和Naf在两种装置中的吸附情况。

结果显示，cOFM在体内AUC比值及RR_vv,D₂O方面均显著优于MD（AUC_OFM/AUC_MD = 2.0，RR_vv,D₂O(cOFM)/RR_vv,D₂O(MD) = 2.1）。除NOR外，cOFM成功检测出所有AMI代谢物，而MD未能检测到HYA、NOR、ANO及Naf。体外实验表明，AMI和Naf在MD膜上表现出强吸附（RR_vt,AMI=4.4%，RR_vt,Naf=1.5%），而在cOFM系统中非特异性吸附可忽略不计（RR_vt,AMI=98%，RR_vt,Naf=98%）。综上所述，cOFM在采样AMI及其代谢物、Naf和D₂O方面性能更优，其D₂O的体内相对回收率约为MD的两倍；MD未能检测到部分物质可能是由于膜吸附作用所致。

为直接比较两种采样方法的性能，研究人员在16只实验动物体内同步进行了cOFM与MD采样，每只动物的两个脑半球各植入一个采样探针，确保两种方法获得完全相同的血浆与脑ISF浓度。然而，不同动物个体之间在血浆、cOFM样本及MD样本中的AMI、Naf和D₂O浓度均表现出高度变异性。这一现象与既往研究结果一致：在腹腔注射AMI后，脑组织活检样本及血浆中的药物浓度均存在显著的个体间差异。血浆浓度的波动可能是导致cOFM与MD样本中AMI及其代谢物浓度差异较大的关键因素。

图1：实验设置示意图

1、AMI及其代谢产物

体外吸附实验显示，cOFM对AMI的RR_vt,AMI为98%（n = 3），而MD仅为4.4%（n = 3）（表3）。AMI的AUC_plasma在个体间差异较大（表1）。血浆中AMI和HYA的浓度随时间推移逐渐下降，而NOR和ANO的浓度则保持稳定（图2 a-d）。cOFM与MD样本中的AMI浓度均存在较大变异，其中cOFM样本的变异程度更高（cOFM：AMI IQR_AUC = 35.4 ng·h/mL；MD：AMI IQR_AUC = 11.2 ng·h/mL）（图3 a-b，表2）。

图2：腹腔快速注射25 mg/kg后，（a）AMI、（b）HYA、（c）NOR和（d）ANO的血浆浓度随时间变化曲线（n = 16）

图3：cOFM样本（a）与MD样本（b）中AMI浓度随时间变化曲线（n = 16）

表1：所有被测物质的AUC_plasma中位数、IQR_AUC、最小AUC值及最大AUC值

表2：cOFM与MD样本中所有被测物质的AUC中位数、IQR_AUC、最小AUC值及最大AUC及AUC比值

表3：cOFM与MD方法中RR_vt,AMI、RR_vt,Naf以及RR_vv,D₂O

所有cOFM样本中的ANO浓度均高于定量下限（LLoQ）（图4 d）。ANO的AUC_cOFM中位数为13.9 ng·h/mL，其AUC_cOFM与AUC_plasma的比值为0.042（表2）。虽然在92%的MD样本中检测到ANO，但仅有约25%的MD样本中ANO浓度高于LLoQ。

图4：cOFM样本中（a）HYA及（b）ANO的浓度随时间变化曲线（n = 16）。

2、D₂O

采样期间，血浆中的D₂O浓度保持稳定（图5），其AUC_plasma为96.1 mg·h/mL（表2）。cOFM样本中的D₂O浓度较MD样本表现出更高的变异性（图6a与6b），且随时间推移逐渐下降；所获D₂O的AUC_cOFM值为26.6 mg·h/mL，与AUC_plasma的比值为0.28。MD样本中的D₂O浓度随时间呈微弱上升趋势，其AUC_MD值为12.7 mg·h/mL，与AUC_plasma的比值为0.13。cOFM与MD两种方法所获D₂O的AUC比值为2.0。cOFM和MD对D₂O的RR_vv,D₂O分别为27.3%和12.9%（表3）。在从ISF中采样D₂O方面，cOFM表现出显著优于MD的性能（p = 0.007，α = 0.05）。

图5：在采样前18小时快速注射21.8 ml/kg D₂O后，血浆中D₂O浓度随时间变化曲线（n = 13）。

图6：（a）cOFM样本与（b）MD样本中D₂O浓度随时间变化曲线（n = 13）。

3、Naf

体外吸附实验显示，在体外测试中未观察到Naf在cOFM探针上发生吸附，但其在MD系统中有显著吸附。cOFM的RR_vt,Naf为98%（n = 3），而MD仅为1.5%（n = 3）（表3）。

Naf的AUC_plasma中位数为189.2 μg·h/mL，其AUC_cOFM中位数为0.7 μg·h/mL（图7、8a及表2）。Naf的AUC_cOFM与AUC_plasma比值为0.004。在所有MD样本中，51%的样本Naf浓度低于LLoQ，另有25%的样本完全未检测到Naf（图8b）。

图7：血浆中Naf浓度随时间变化曲线（n = 16）。

图8：（a）cOFM样本与（b）MD样本中Naf浓度随时间变化曲线（n = 16）。

• 脑部开放式微灌流（cOFM）在采样亲脂性物质AMI及其代谢产物、亲水性物质Naf以及D₂O时表现出更优的性能，其RR_vv,D₂O约为MD的两倍。

• 利用cOFM采样时，除去NOR外，所有被分析物均被成功检出。

• MD采样未能检测到AMI的代谢产物HYA、NOR和ANO以及Naf，这很可能是由于这些物质在MD膜上的吸附所致。

• 这种吸附作用不仅限制了小分子亲脂性物质的跨膜交换，也对具有芳香结构的小分子亲水性物质（如Naf）的传输造成阻碍，表明芳香-芳香之间的相互作用可能在物质吸附过程中扮演了重要角色。

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参考资料：

Altendorfer-Kroath T, Schimek D, Eberl A, Rauter G, Ratzer M, Raml R, Sinner F, Birngruber T, Comparison of cerebral Open Flow Microperfusion and Microdialysis when sampling small lipophilic and small hydrophilic substances, Journal of Neuroscience Methods (2018), https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2018.09.024