实验探究 | OFM微灌流技术用于活体大鼠皮下动态取样的方法学探索
开放式微灌流（Open Flow Microperfusion, OFM）是一种先进的在体采样技术。该技术采用具有100微米孔口的无膜探针[1]，将其植入皮肤等目标组织后，持续灌注生理相容的灌流液，并通过推拉泵系统控制灌流液的流动路径，实现基于对流方式的物质交换。组织间隙液中的目标分子（如药物、代谢物等）可动态扩散进入探针内部，并被连续收集，从而实现对活体组织中物质变化的实时、动态监测。
OFM开放式微灌流
与传统依赖半透膜进行选择性扩散的技术不同，OFM无膜探针凭借其开放的孔口结构和生物相容性材料，能够允许组织间隙液中的各类物质——从小分子代谢物到大分子蛋白乃至抗体[2-5]——直接、无选择性地随灌流液流出。这一结构从根本上避免了因分子量差异所造成的截留问题，并显著降低了传统微透析技术中常见的“吸附损失”[6]，从而实现对活体组织微环境中多种物质更全面、更真实的高效回收[1]与动态监测，使其成为药代动力学与代谢研究中的重要工具[7]。
为了探索OFM技术在活体大鼠皮下取样方法的可行性，我们设计了如下探索实验。在合邦科仪北京应用中心还提供以下专业解决方案：
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TDDS真皮层药代模型（OFM+离体猪皮/SD大鼠/离体人皮肤组织）
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TDDS高通量配方筛选模型（ABS100+离体人皮肤组织）
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骨关节模型（OFM+鼠/猪骨关节腔）
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透甲模型（ABS100+人甲）
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皮肤刺激性模型（离体人皮肤组织）
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脑部PK模型（OFM+动物脑部）
欢迎咨询。
使用微灌流（OFM）技术完成对活体大鼠皮下物质动态取样，同时进行串扰和体内稀释因子的测定。
仪器设备：OFM微灌流主机、探针、管路、转接头、穿刺针，高频B超
样品：利多卡因凝胶贴
试剂：氯化钠、庆大霉素、麻醉剂
实验动物：雄性SD大鼠2只（约220g），鼠1进行串扰实验和取样预实验；鼠2测定稀释因子后进行正式实验，根据鼠1实验结果设置探针间隔和取样时间点。
3.1实验准备
3.1.1 灌注液配制
称取9g NaCl溶解于蒸馏水中，并定容至1000 ml，配制成含0.01%硫酸庆大霉素的灌注液。
3.1.2 线性微灌流探针的植入
（1）大鼠麻醉后固定备皮（实验过程中根据麻醉情况随时补加麻药）；
（2）在大鼠腹部标记药贴给药部位；
（3）用手术记号笔在皮肤表面标记穿刺入口与出口，间距约 30 mm；
（4）取穿刺针进行穿刺，高频B超验证穿刺深度。
（5）将探针从穿刺针尖端缓缓穿入，勿触碰或挤压探针交换区。撤出穿刺针，调整探针，使交换区位于入口与出口之间，用手术胶封闭探针的入口和出口点；
（6）在药贴对称位置（需测量距离）处埋入一根探针（空白，实验中为右侧R），用于做串扰研究。
穿刺位置如下图：
图1 鼠1（右）和鼠2（左）穿刺状态，串扰探针位置距离药贴2cm。左侧用L表示，右侧用R表示。
图2 高频B超验证穿刺深度
OFM基础操作及串扰实验操作，可点击以下视频进行观看：
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3.2 药物体内稀释因子的测定
鼠2以1 μL/min流速灌流灌注液，平衡1 h后，换成已知浓度含药灌注液（浓度约为定量限3倍，使用前需取样测定Cperfusate）的灌注液平衡1 h后，以1 μL/min的流速进行皮肤微灌流采样（Cdialysate），采样间隔30 min，每份样品30 μL，连续收集3份立即测定，按下式计算体内稀释因子：
注：鼠1不测定稀释因子
3.3 皮肤中目标物浓度的测定及串扰测定
鼠2测完稀释因子清醒过夜，第二天麻醉后，以1 μL/ min流速灌注生理盐水平衡1h，每隔30min取样，连续测定2h。确认体内检测不到利多卡因后，以1 μL/ min的流速继续灌流灌注液，然后在大鼠腹部左侧给药（药贴裁切为直径15mm圆形药贴，给药时间3h后揭除），右侧不给药。同时开始收集皮肤微灌流样品，取样时间间隔根据鼠1实验结果选取(皮肤连续取样待定8 h），直接进样分析测定透析液药物浓度并经体内稀释因子校正：
若空白位点（右侧不给药部位）检出药物浓度在给药位点药物浓度的5%以内，则表明设置间距无串扰，可作为后续实验上样的最小间隔。
3.5 数据处理
（1）确认不发生串扰的间距（鼠1）；
（2）以目标物质浓度对采样时间点作药一时曲线图，确认取样时间间隔（鼠1）；
（3）计算体内稀释因子数据（鼠2）；
（4）根据体内稀释因子数据校正正式实验数据和曲线（鼠2）。
4.1 鼠2体内稀释因子数据
鼠2左右两侧稀释因子均约为84%。
表1 鼠2体内稀释因子数据
4.2 药物浓度数据及药物浓度-时间浓度曲线图
图3 鼠1药物浓度-时间曲线
鼠1左侧的药物浓度在4h达到最高，为4.39ug/ml；右侧未检测到药物。根据鼠1的药物浓度-时间曲线推测，药物的Cmax可能出现在3-4h之间，因此对鼠2正式实验采样时间点增加了3.5h时间点。
图4 鼠2药物浓度-时间曲线
鼠2左侧的药物浓度在3.5h达到最高，为7.12ug/ml；右侧未检测到药物。
4.3 根据体内稀释因子校正后鼠2药物浓度-时间曲线图
图5 鼠2校正后药物浓度-时间曲线
1、在两次实验中，位于给药点2厘米处的对侧（考察串扰部位）均未检测到药物，证明该距离可有效避免串扰，可作为后续研究的最小安全距离。
2、基于OFM技术的药物浓度-时间曲线重现性良好，证实该方法具有较高的可靠性。预实验测得，鼠1的Cmax在4h，为4.39ug/ml。
3、鼠2左右两侧稀释因子均约为84%。根据鼠1预实验结果调整采样时间点后，鼠2的Cmax在3.5h，为7.12ug/ml。
4、本次探索成功验证了OFM微灌流技术用于活体大鼠皮下动态取样的可行性与可靠性。OFM技术能直接在药物“作用靶部位”取样间质液，避免传统血浆检测“间接推断”的误差，为体内-体外相关性研究及高效经皮制剂研发提供新思路。
参考文献：
[1] Custers ML, Wouters Y, Jaspers T, et al. Applicability of cerebral open flow microperfusion and microdialysis to quantify a brain-penetrating nanobody in mice. Anal Chim Acta. 2021 Sep 15;1178:338803.
[2] Bodenlenz M, Höfferer C, Magnes C, et al. Dermal PK/PD of a lipophilic topical drug in psoriatic patients by continuous intradermal membrane-free sampling. Eur J Pharm Biopharm. 2012;81(3):635–41.
[3] Bodenlenz M, Aigner B, Dragatin C, et al. Clinical applicability of dOFM devices for dermal sampling. Skin Res Technol. 2013;19(4):474–83.
[4] Dragatin C, Polus F, Bodenlenz M, et al. Secukinumab distributes into dermal interstitial fluid of psoriasis patients as demonstrated by open flow microperfusion. Exp Dermatol. 2016;25(2):157–9.
[5] Bodenlenz M, Dragatin C, Liebenberger L, et al. Penetration of clobetasol-17-propionate into psoriatic lesional and non-lesional skin assessed by dermal open flow microperfusion with time and space resolution. Pharm Res. 2016.
[6] Altendorfer-Kroath T, Schimek D, Eberl A, et al. Comparison of cerebral Open Flow Microperfusion and Microdialysis when sampling small lipophilic and small hydrophilic substances, Journal of Neuroscience Methods (2018), https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2018.09.024
[7] Eirefelt S, Hummer J, Basse LH, et al. Evaluating Dermal Pharmacokinetics and Pharmacodymanic Effect of Soft Topical PDE4 Inhibitors: Open Flow Microperfusion and Skin Biopsies. Pharm Res. 2020 Nov 13;37(12):243.
