好文分享 | 从“拆脑”到“看脑”：脑内药代动力学的技术革命与策略全景图

导读

大脑作为人体最精密的器官，其独特的血脑屏障在有效保护中枢神经系统的同时，也为药物递送构筑了重要屏障。药物能否入脑、何时入脑、在脑内如何分布与清除，成为决定脑部疾病治疗成败的关键科学问题。在此背景下，脑内药代动力学研究发展起来，其精确刻画药物在脑组织内的动态轨迹与代谢命运，已成为脑部药物研发的核心环节。脑内药代动力学研究不仅为脑靶向药物的精准递送与疗效优化提供依据，也有助于规避非靶向药物潜在的神经毒性风险。

近年来，一系列脑内药代动力学研究技术被开发出来。脑组织匀浆、脑脊液抽取等传统方法为该研究奠定了基础，脑微透析实现了在体连续采样；质谱成像让我们得以“看见”药物在脑精细结构中的分布；放射性核素成像则能无创追踪药物的行踪。

值得注意的是，微灌流（OFM）技术在此过程中展现出其独特价值。它不仅延续了微透析连续、在体采样的优点，更凭借其无膜开放式设计，克服了微透析方法对亲脂性药物和大分子（如抗体、蛋白）回收率低的局限。尤为关键的是，OFM探针植入后允许血脑屏障愈合与重建，能在屏障完整的真实生理状态下进行采样，从而获得了远比传统方法更准确、更可靠的定量数据，为精准评估药物入脑效率提供了强大工具。

今天我们将与大家分享一篇综述性文献《脑内药物代谢动力学研究策略及前沿技术进展》，该文章系统梳理了脑内药代动力学领域的研究策略演进与技术前沿动态，有望为相关科研与实践提供理论参考。

引言

药物代谢动力学通过定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄动态变化规律，反映机体对药物的处置过程，以血药浓度的监测为主。血脑屏障( blood-brain barrier，BBB) 是存在于血液和脑实质之间的具有选择通透性的动态交换界面，在限制有害物质进入的同时，屏障上紧密排布的细胞和多种摄取或外排转运体也限制了药物在脑内的分布，约98%的小分子药物以及接近100%的大分子药物都难以通过。药物透过BBB 的程度与药物自身性质、BBB 完整性和所含药物转运蛋白功能有很大程度的关系。当BBB 对药物的通透性发生改变时，临床治疗药物监测所获得的血药浓度可能无法准确反映脑内药物浓度。简单地使用血药浓度作为中枢神经系统( central nervous system，CNS)中药物浓度的替代指标可能会导致剂量不足，而当非CNS药物进入脑组织产生的治疗外作用存在扰乱动物高级神经活动的风险时，对药物治疗的有效性、安全性均带来潜在的危害。

因此，对脑内药物浓度以及药物在脑内处置过程的监测显得尤为重要。研究药物在脑组织内的代谢动力学可以判断CNS 药物是否到达脑内，甚至更精细的结构，在脑内能否到达安全有效的浓度; 同时也可以判断非CNS 药物于脑内的处置过程，在药物于脑内的药效学与毒理学预测方面具有重要意义，对降低新药开发风险发挥着重要作用。本文根据国内外已有报道，对脑内药代动力学研究方法的沿革与发展进行综述，客观评价各种技术方法的优势与局限性，为脑组织内药物疗效作用、毒性作用预测提供参考。

传统脑内药代动力学研究策略

2.1 脑组织匀浆法

脑组织匀浆法因采样操作简单而成为脑内药代动力学研究最经典的方法。全脑匀浆法结合分析技术能够直接测定给药后脑组织总药物浓度( 包括游离型与结合型) ，从而预测药物在脑内的处置过程。张郑等通过全脑匀浆法考察了丹参素冰片酯在脑内分布的长效缓释特性，给药后先缓慢分解得到丹参素，随着给药时间延长分解得到的丹参素含量提高。与此同时，蛋白免疫印迹法提示丹参素冰片酯能够明显降低P-糖蛋白( P-glycoprotein，P-gp)表达水平，减弱丹参素冰片酯及丹参素的外排转运。全脑匀浆法虽简单易行，但药物可能进入BBB 紧密连接的血管内皮细胞、星形胶质细胞，从而产生阳性结果，使其仅能判断药物是否到达BBB，无法确定药物是否透过BBB。分离特定脑区/核团匀浆分析能够弥补全脑匀浆的不足。喻斌等对脑组织中特定脑区大脑皮层、海马、下丘脑和纹状体进行匀浆，探究冰片对川芎脑组织药动学的干预作用。冰片干预后，各脑区AUC0-t及Cmax均升高，且生物利用度存在皮层＞海马＞下丘脑＞纹状体的关系，提示冰片促进川芎有效成分透过BBB 入脑，并在特定脑区布。

脑组织匀浆法需要在不同时间点批量处死动物，取脑组织，无法实现同一实验个体多次采样，实验动物、受试药物消耗量大，动物的个体差异性导致实验数据异常波动而产生误差，限制了脑内药代动力学的深入研究。

2.2 脑脊液抽取法

脑脊液( cerebrospinal fluid，CSF) 抽取法以小脑延髓池为采样点，可以实现一定次数的CSF 采集，在实验动物与受试药物节省方面强于脑组织匀浆法，得到了一定程度的应用。CSF 蛋白质含量极低，其药物浓度常被用作CNS 游离药物的替代指标。CSF－血浆共同药代动力学分析能够对药物的BBB 穿透率进行评估，在大鼠模型中，头孢吡肟AUCCSF /AUC血浆为19%，表明其转运到CSF 是快速且高度可预测的，大鼠模型的结果与人类研究的结果高度一致，对于临床头孢吡肟的治疗窗及神经毒性的理解十分有益。

CSF 中的药物水平虽然常被用作药物向脑组织输送的证据，但CSF 循环的运行远慢于血液循环，使得CSF 内容物得不到充分的混合，根据取样位置/时间和给药途径的不同，CSF 中的药物浓度可能会有很大差异。该方法在定位、操作方面难度均较大，操作不当易导致动物脑组织损伤而影响存活率，或使血液污染CSF 而无法重复采样。

原位在体分析策略

3.1脑微透析技术

20 世纪80 年代微透析技术进入脑内药代动力学研究领域，脑微透析( cerebral microdialysis，CMD) 获取的信息来自脑细胞外液( extracellular fluid，ECF) ，又称脑组织间质液( interstitial fluid，ISF) ———神经活性化合物作用的关键部位，比CSF 抽取法更能真实反映CNS 药物作用过程。CMD 所采集的游离型药物为评估药效学以及药物在BBB 中的转运提供了机会，使化合物的脑内药代动力学特征与其神经药效学特征相关联。

CMD 技术在脑内药代动力学研究领域中具有独特的优势，可实现同一实验个体的连续采样，减少实验动物数量，降低实验成本，解决传统方法中无法解释的数据波动问题，获得较为真实的药物浓度－时间曲线。微创性的微透析探针能保持采样期间清醒/麻醉动物生理状态稳定。Zhu 等将脑探针植入左侧纹状体后，脑透析液样本的收集可持续至36 h，血管肽-2 受体介导的脑靶向修饰颗粒显示出较高的靶向效率( 20.6%) 和较低的清除率( 原型药物的19%) ，增强了脑组织中的药物积累，从而提高其治疗脑肿瘤的生物利用度。当脑内同时埋植多个探针时，也可实现多部位取样。Chang 等植入多个探针于纹状体、侧脑室、枕大池，直接测量了曲妥珠单抗在大鼠脑内多个作用部位的药物浓度时程变化，并进一步将血浆与脑内不同区域的单抗浓度建立可靠的定量关系。除药物以外，其他内源性分子也可以在微透析液中进行分析，以获得下游靶点和/或脑组织能量代谢的信息。Wang 等评价刺五加叶给药后，慢性脑缺血大鼠的海马中6 种活性成分的药代动力学行为，并以乙酰胆碱、谷氨酸、甘氨酸等神经化学分子变化监测神经代谢变化，建立了脑缺血海马区药代动力学和药效学之间关系的可视化表达方法，为阐明中药刺五加物质基础和作用机制奠定了基础。

然而，微创性的CMD 对实验人员操作有较高要求，植入探针过程可能会引起毛细血管破裂、BBB 功能破坏和周围突触形态变化，使化合物通过开放的BBB 从血液渗漏到脑中，影响脑内的化合物定量结果。除此之外，亲脂性物质与高分子物质的采样存在挑战。亲脂性物质倾向于吸附在微透析膜上，限制跨膜的交换，大大降低其灵敏度，增强对亲脂性分析物的过滤作用; 大分子截留量探针的大孔径使得物质主要通过对流携带，以超滤机制进行交换，对渗透压的变化更加敏感，导致透析液体积和分析物浓度具有更多不确定性。

3.2 脑开放式微灌注

脑开放式微灌注( cerebral open flow microperfusion，cOFM) 是脑原位分析的新技术，保留了CMD技术连续、微创间质采样的特点，提供空间与时间分辨数据，动态监测特定脑区药物浓度。不同之处在于， cOFM 技术允许BBB 在探针插入后愈合和重建14 d，提供了在BBB 完好的情况下取样脑间质液中化合物的机会。实验过程中常用荧光素钠( Naf) 进行标记，以连续监测BBB 通透性，样本中低Naf 浓度提示了整个实验过程中BBB 的完整性得到了保障，从而保证了定量的准确性。

已有研究表明， cOFM 探针的长期植入对周围组织无明显影响，没有阻碍物质交换的胶质瘢痕化与星形细胞、小胶质细胞的反应，可以长期连续取样。Kleinert 等以尾静脉采血和cOFM 联合的方法，创建了C57BL/6J 小鼠外源性瘦素的外周和下丘脑药代动力学组合特征，并证明在非肥胖瘦素抵抗小鼠中，瘦素通过BBB 的转运并未受损，解决了“瘦素的BBB 转运是否从瘦素抵抗中获得”的争论。cOFM基于无膜开口( 100 μm) 的探针和推拉泵的组合，使灌流液与脑组织直接接触，避免了微透析膜可能出现的膜污染、凝血等限制性问题，使得亲脂性化合物的非特异性吸附最小化，大分子物质微透析时有关渗透压和超滤的问题也可以得到很好的解决。有研究比较两种方法对小分子脂溶性物质的适用性， cOFM 所检测的脑内暴露量是CMD 的2 倍，并且cOFM 的探针体外回收率是CMD 的20 倍之多。Custers等于清醒自由活动的小鼠脑内也得到了相似结果。需要注意的是，无膜结构使得所采集样品未经过滤，联合分析技术分析前，需要对样品进行预处理，且测定结果为ISF 中的药物总浓度( 包括游离和结合部分)，影响其对药效学的评估。

FDA推荐BE测试方法——OFM开放式微灌流

微创、连续、活体取样
探针无膜，开放式交换
适用于小分子/大分子药物，亲水/亲脂性物质，多肽，蛋白，抗体，结合药物与游离药物，转运体，酶，纳米载体和囊泡等的活体取样

结合合邦科仪公司专业仪器设备及耗材，还可提供以下解决方案：

1、皮肤真皮层药代模型（OFM微灌流+离体猪皮/SD大鼠/离体人类皮肤模型）

2、皮肤真皮层药代高通量配方筛选模型（ABS100全自动在线生物系统+离体人类皮肤模型）

3、骨关节模型（OFM微灌流+猪骨关节腔）

4、透甲模型（ABS100全自动在线生物系统+人甲）

5、皮肤刺激性模型（离体人类皮肤模型）

6、脑部PK模型（OFM微灌流+动物脑部）

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可视化成像研究策略

4.1 放射性成像

4.1.1 全身放射自显影技术

全身放射自显影( whole body autoradiography，WBA) 与磷屏技术结合所形成的定量全身放射自显影( quantitative whole-body autoradiography，QWBA) ，提供了放射性药物可视化空间分布图像和匹配的放射性药物组织浓度，已成为药代动力学研究中定性和定量描述的重要手段。QWBA 通过在特定时间点处死动物并将组织冷冻，保证了组织水平原位浓度的真实性及可靠性，以最小的样品处理/改变达到研究者探究组织真实状况的目的。

QWBA 仅用于观察和量化脑组织矢状面的放射性药物含量。潘绵立等在整体矢状切片下分析了14 C-甲基苯丙胺( 14C-METH) 静脉给药后，于小鼠脑内的分布，其起始分布和消除较快。而此方法对冠状面和脑组织精细结构的检查仍显不足，潘绵立等又对小鼠头部的冠状切片进一步探究，考察同一脑组织不同冠状切片中放射性药物的浓度，以确定14C-METH 在脑组织不同区域的分布密度，得到的结论是METH 随着血流迅速进入脑灰质，分布广泛且均匀。为了关注药物在脑组织特定区域的分布和作用过程，研究人员还可以在处决动物后迅速解剖脑组织，进行离体脑组织后续的冷冻和成像操作。

然而，QWBA 缺乏特异性，仅能检测研究者标记的特定放射性核素，无法提供分子结构信息，因此无法将母体药物与其代谢物区分开。换言之，放射性浓度并不总是等同于被标记的原始化合物的浓度，它还可能包括与代谢物和/或降解产物相关的放射性。小分子蛋白35 S-NBN 总放射性在脑中的分布极低( 小于初始剂量的0. 3%) ，5 min 时在脑组织中检测到的放射性很可能是由于组织中的残余血液造成的。在之后的时间点，脑组织放射性的增加很可能是由于放射性标记的蛋氨酸和半胱氨酸循环到其他蛋白质。

4.1.2 核成像技术

1973 年，X 射线计算机断层扫描( computed tomography，CT) 的出现促进了核成像技术领域的发展，特别是正电子发射断层扫描( positron emission tomography，PET) 和磁共振成像( magnetic resonance imaging，MＲI) 的出现为脑组织中的药代动力学研究提供了可视化方案。相较于QWBA，活体的无创核成像提供了真实的药物可视化信息和实时药物分布追踪，为多种分子药物在脑内提供体内定量的空间分辨药代动力学和药效学测量。

PET 根据放射性物质活性衰减进行定量检测，放射配体的脑摄取用时间－放射活性曲线下的面积( AUC) 来描述。有研究评价环孢素A( CsA) 对［11 C］-dLop 在狒狒脑内的动力学影响，CsA 注射导致AUC10-30较基线值增加了12 倍，CsA抑制P-gp 导致脑组织放射性显著增加，且放射性随时间逐渐增加，甚至在分布期之后也是如此。小动物PET 的空间分辨率为1 ～ 2 mm，可以聚焦于测定脑组织中特定区域药物浓度。Xin 等通过脑胶质瘤对放射性示踪剂的摄取明显高于正常脑组织以精确定位脑肿瘤，L－l－［¹⁸ F］ FETrp可以透过脑胶质瘤小鼠模型的BBB，并在73C 胶质瘤中积累( 4. 1 ± 0. 7) % ID/g，强有力地支持了精确的脑肿瘤诊断与治疗的临床转化。

PET 有利于追踪放射性分子，但获得的图像空间分辨率较差，难以准确识别吸收区，往往需要与能提供解剖定位的其他技术结合，以观察局部组织分布情况，如PET/CT、PET/MＲI 等。与QWBA 类似，PET 难以区分母体药物和其放射性代谢物。“动脉输入功能”的引入提供了放射性物质脑－血浓度之间的关系，以更好地定量描述PET 数据，直接测量到达脑组织的放射性标记药物的总浓度。然而，动脉血连续采样困难、半衰期短的放射性核素于扫描后期的恒定浓度不准确等问题，使得该项功能也成为PET 中最易出现错误的环节。数学生物修饰后，高度蛋白结合化合物的非特异性结合成分并未进行排除。有研究将PET 与体外平衡透析相结合，评估［11C］－洛哌丁胺的游离浓度及其转运过程。该联合分析手段排除了非特异性结合成分，可能成为CNS 药物开发的有用工具。

4.2 质谱成像技术

质谱成像( mass spectrometry imaging，MSI) 是一种无标记分子成像技术，可获得待测样本中任意指定质荷比离子( m/z) 的可视化图像，以同时提供药物和其他分子在生物样本中的空间定位信息，弥补放射性成像技术特异性不足与放射性标记过程繁琐的问题，在脑内药代动力学研究中发挥着关键作用。

MSI 通过生成脑组织样本的离子强度图，定性评价药物透过BBB 能力，以及药物在脑组织特定区域的分布。MALDI-MSI 显示，埃替拉韦透过BBB 并广泛分布在整个脑组织。注射1 h 后，丘脑、下丘脑和胼胝体观察到m/z 448. 21 离子的累积。脑组织中特定脑区的分布特征对预测药物疗效有重要意义。抗中枢神经系统HIV 药物奈韦拉平集中分布在与神经退行性病变有关的脑区，药物在相应脑区停留时间较长，提供更高的CNS 疗效。肿瘤微环境的异质性直接影响药物的渗透，降低治疗效果，并促进耐药的发展，MSI 能够将实体肿瘤中观察到的药物分布特征与肿瘤异质性联系起来。与异位肿瘤相比，MK-1775 在原位移植肿瘤中的积聚明显较低，某些区域的MK-1775 暴露水平甚至与正常脑组织相似，表明MK-1775 在脑肿瘤内的异质性聚集可能限制了其治疗胶质母细胞瘤的疗效。

MSI 已由定性、半定量发展至定量成像，将组织切片中相应区域的药物峰值强度根据标准曲线转换为药物浓度。MSI 的最大空间分辨率根据离子源和样品特性不同，可以从50 nm 到200 ～ 300 μm，高空间分辨率使得MSI 定量分析脑组织特定区域成为可能。Kallback 等以MALDI-MSI 考察了丙咪嗪于小鼠脑组织尾壳核、大脑皮层、海马区、黑质、丘脑中的分布及含量。定量成像的应用对药物的脑内药代动力学参数有着更准确的描述，为药物的临床转化提供更可靠的参考。

MSI 通过选取不同质荷比实现生物体内多种分子的高覆盖检测，将药物分布信号与内源性分析物共定位，作为疾病进展、治疗效果或毒理学的生物标记物。Ｒzagalinski 等利用FTICＲ-MSI 评估特利氟米特穿过BBB 的能力，同时通过成像实现了对药物作用下CNS 内源性化合物的空间及定量分布变化的观察。嘌呤和嘧啶核苷酸以及谷胱甘肽和碳水化合物代谢中间体的差异，揭示了特利氟米特对小鼠脑组织代谢网络的潜在影响，提供了药物在分子水平上作用的更多见解。

微观细胞药代动力学

王广基课题组将药代动力学拓展到细胞/亚细胞水平，于2011 年尝试性提出“细胞药代动力学”理念，以阐明药物进入细胞的方式，胞内及亚细胞靶点处药物含量，真实有效地预测机体具有生理屏障的特殊组织( 肿瘤、脑、胎盘等) 中的药物作用，作为组织药代动力学的有益补充。液－质联用既具有液相强大的分离能力，又具有质谱高灵敏度、高选择性、高分辨率的特点，已经成为药代动力学最常用的分析工具之一。Liu 等根据绘制的浓度－时间曲线，在SH-SY5Y 细胞中考察了银杏内酯A( GA) 和银杏内酯B( GB) 的细胞内摄取、亚细胞分布。GA和GB能够迅速分布到亚细胞器中，在细胞核和胞质中的积累量缓慢下降后增加，在亚细胞细胞器中发生了重新分布的过程。药物分子的细胞摄取与分布也常以标记信号评估，如放射性、荧光信号等。激光共聚焦扫描显微镜可以定量、实时地观察细胞的结构以及细胞中荧光标记药物分子的分布状态。吐温－ 80 修饰后的纳米胶束C6-THSC 在处理4 h 时，细胞质中出现强烈的绿色荧光，表明能够更好地逃脱小鼠胶质瘤细胞G422 细胞的溶酶体，避免溶酶体诱导的降解，有助于药物的抗肿瘤作用。

质谱技术推进了亚细胞分辨率代谢成像的重大进步，细胞/亚细胞水平上的质谱成像可以提供药物传递机制、动力学的关键细节。3D OrbiSIMS 实现了在组织、细胞和亚细胞尺度下对小鼠海马区进行分子成像，分析脂肪酸、甾醇、甘油磷脂和鞘磷脂等在神经退行性疾病中发挥重要作用的分子，在与HE 染色组织切片的叠加及比较中进一步提供了分子病理学的有益补充。

结语

随着人们对脑组织精细结构的认知不断加深，脑内药代动力学研究理论与技术的不断进步和完善，在沿革发展过程中，每种技术方法都有其突出的优势和相应的不足之处(表1) 。最早的脑组织匀浆法、CSF 抽取法等完全侵入式技术，由于动物消耗量巨大而产生难以解释的数据稳定性，成为该方法的主要困难。1974 年兴起和发展的CMD 技术以及在此基础上改良的cOFM 作为半侵入式的代表，实现了在体连续采样，并对机体影响较小，动物消耗量明显减少并提升了数据的可靠性。与此同时，微透析因提供游离型药物采集，成为神经活性药物药代动力学研究中不可或缺的一部分。

表1. 脑内药代动力学技术的特征比较

半侵入性技术的侵入程度对BBB 完整性的影响可能导致脑内药物浓度定量存在偏差，从而影响实验结果，由此便诞生了非侵入式技术方法。非侵入式成像技术除了提高空间分辨率以外，还被赋予了捕捉药物在脑内各精细结构中的动态过程的能力。放射自显影技术和核成像技术均能用于在体脑内药代动力学研究，后者甚至能够进行活体无创成像。核成像技术PET 与能提供精确脑解剖视图的CT 或MＲI的联合应用，已被普遍用于药物分布的可视化及治疗效果的判断。虽然上述成像方法在其适用范围内效果良好，但与更近期的质谱成像技术相比，它们的潜力还有所欠缺，其放射性标记过程繁琐、耗时，成像分辨率、特异性不足的问题，已成为阻碍其深入脑内药代动力学研究的主要障碍。质谱成像技术以质谱分析质荷比的独特优势，大大提高成像的特异性，并赋予同时分析定位多种分子的可能性。质谱成像除定性、定量、定位以外，还能够与功能相互关联，将药物与内源性分子共定位，为疾病进展、治疗效果或用药安全提供参考。

如今，脑内药代动力学研究已从宏观走入微观，从在体组织水平延伸到细胞/亚细胞水平，推动了体外到体内的预测、转化，解决组织药代动力学可能存在的PD/PK 不一致的情况。以上技术方法互相补充、日益完善，逐渐形成“亚细胞－细胞－组织”全方位的脑内药代动力学研究体系，在指导CNS药物临床应用的同时，也能够防止非靶向药物对脑组织的毒性与损伤，成为支撑未来药物研发的重要技术体系之一。

参考文献：

班玮康,杨志宏.脑内药物代谢动力学研究策略及前沿技术进展[J].中国药理学通报, 2023, 39(9):1607-1612.DOI:10.12360/CPB202205073.

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