优于皮肤穿刺活检！OFM 突破性LCMS质谱前端活体动物采样技术用于精准评估药物疗效

近年来，经皮给药制剂凭借其独特的优势，如有效避免首过效应、显著降低血药浓度波动，极大地提升患者的用药依从性，已成为药物研发领域中的一个热门方向。伴随着经皮给药制剂研究的不断深入，一系列旨在评估其生物等效性的前沿新技术也不断涌现。

皮肤开放微灌流（dOFM）是一种微创连续采样方法，它可以直接在体内进入目标组织间质液，利用无膜探针进行取样。dOFM扩大了可分析物质的范围，可用于小分子/大分子药物，亲水/亲脂性物质，多肽，蛋白，抗体，结合药物与游离药物，转运体，酶，纳米载体和囊泡等的取样，有望在透皮给药制剂的生物等效性评估中发挥重要作用。

今天，我们将为大家分享一篇文献：《Evaluating Dermal Pharmacokinetics and Pharmacodymanic Effect of Soft Topical PDE4 Inhibitors: Open Flow Microperfusion and Skin Biopsies》https://doi.org/10.1007/s11095-020-02962-1，供各位老师参考，文章详情见下文。

特应性皮炎(AD) 是一种慢性炎症性皮肤病，其特征是皮肤出现湿疹斑块。在西欧和北美国家，儿童患病率为15-30%，成人患病率为2-10%，在发展中国家呈稳步上升趋势。磷酸二酯酶(PDE)-4抑制剂作为抗炎药物的开发已经进行了很长时间，大多数已评估的PDEA抑制剂都是口服给药，使用剂量受到与靶标相关的不良反应(如呕吐和恶心)的限制。皮肤疾病的局部治疗是一个有吸引力的选择，因为这种类型的局部药物递送可以更直接地到达皮肤靶标，并达到较高的局部皮肤浓度，同时保持较低的全身浓度，从而最大限度地减少不良反应。研究人员在之前的项目中将PDE4抑制剂设计成能够迅速从体循环中清除，同时在皮肤中保持足够的稳定，PDE4抑制剂在其结构中具有内置的“软点”，使其对肝脏和/或肝外代谢敏感，最大限度地减少对体循环的暴露。

在这个项目中，研究人员确定了几种PDE4抑制剂，并在患者中进行了临床试验。结果显示，化合物LEO 29102在AD患者中显示出临床疗效，而化合物LEO 39652与空白对照相比没有效果。但是，皮肤穿刺活检药物浓度显示，这两种化合物都有较高的皮肤吸收，加之体外药效相似，两种化合物理论上应该具有相似的临床疗效。

能够准确确定相关皮肤区域中的药物浓度，对于了解局部给药药物的PK/PD关系是很重要的。胶带剥离、皮肤活检和抽吸水泡等是常用的几种方法，但这些方法大都是侵入性的，需要大量的样品制备过程，并且存在无法区分游离药物和与组织结合的药物的问题。皮肤微透析(MD)是一种侵入性较小的方法，可以测量吸收的速度和程度以及真皮间质液中的游离药物浓度。然而，对于亲脂和/或大分子药物皮内取样，MD存在局限性。相比之下，皮肤开放式微灌流(dOFM)使用完全可渗透的网状探针，有助于克服MD存在的局限性，已成功用于研究皮肤药代动力学、皮肤生物利用度和皮肤生物等效性。

在本研究中，为了找出两种PDE4抑制剂LEO 29102和LEO 39652存在临床疗效差异的原因，研究人员探索了dOFM作为测量皮肤隔层中药物浓度的手段，将暴露水平与药效学反应标志物环磷酸腺苷(cAMP)联系起来。将临床配方应用于完整或屏障受损的人类皮肤样本，采集皮肤活检样本和皮肤间质液样本进行药物浓度测量，并通过测定皮肤活检中的cAMP水平来评估靶点结合情况。

离体人皮肤中的靶点结合

如图2 a所示，局部给药不同强度的LEO 29102 21小时后，皮肤cAMP水平在完整和胶带剥离的离体人皮肤中均显示出剂量依赖性的增加。胶带剥离皮肤的cAMP水平在所有剂量强度下都较高，表明PDE4抑制水平较高。局部给药LEO 39652后，皮肤cAMP水平与空白处理的样品相当，仅在胶带剥离的皮肤中略高。这一数据表明，LEO 39652强度制剂未达到PDE4抑制，或达到低抑制。组织学证实了胶带剥离去除了角质层，并通过苏木精/伊红染色对完整皮肤(图2b)和胶带剥离皮肤(图2c)进行了可视化。

dOFM测定间质液浓度

在具有完整角质层的人体皮肤切片中，三种评估剂量的LEO 29102的皮肤间质液（dISF）总浓度在施用后2-4小时至24小时内均可通过dOFM检测到。大约12小时后，所有剂量的dISF浓度都达到了平台，随后保持不变。施用24小时后，三种不同剂量的dISF浓度分别为100、360和1200nM。dISF浓度与给药剂量近似成正比。

在胶带剥离角质层的离体人皮肤上，LEO 29102施用剂量为4.25g/cm²。在此实验中，LEO 29102在2-4小时后达到最大dISF浓度，然后在接下来的20小时内浓度缓慢下降。24小时时dISF浓度为2200 nM，即比在相应剂量下在皮肤中测定的dISF浓度高约6倍。

LEO 39652用于胶带剥离角质层的离体人皮肤上，剂量相当于LEO 29102的中剂量(4.25μg/cm², 2.5 mg/g)。实验结束后8小时，原化合物和标志物（cAMP）的dISF浓度都在增加(图4)。在所有时间点，标志物（cAMP）的浓度都比原化合物的浓度高约10倍。8 h时原化合物和标志物（cAMP）的总dISF浓度分别为33和300 nM(图5)。

穿刺活检测量的皮肤浓度

LEO 29102 的皮肤浓度也通过打孔活检在平行部位的人体皮肤切片中进行测量，这些切片与dOFM部位采用相同的处理方法（相同的化合物、浓度和剂量）。皮肤穿刺活检检测到的LEO 29102浓度明显高于dOFM检测到的dISF浓度。三种不同剂量的LEO 29102(1.8、4.25和15μg/cm²)作用于完整皮肤后，活检浓度分别为0.69、12和25μM，约是dISF浓度的6.9倍、33倍和21倍。当中剂量(4.25μg/cm²)应用于胶带剥离皮肤时，皮肤穿孔活检测得浓度为32μM，约为dISF浓度的15倍(图5)。

在皮肤穿刺活检中测量了LEO 39652的原化合物和标志物（cAMP），LEO 39652在皮肤活检中的浓度也明显高于dOFM测量的dISF浓度。施用4.25μg/cm²后，原化合物和标志物（cAMP）的浓度分别为0.45μM和2.0μM，是dISF浓度的14倍和6.7倍(图5)。LEO 39652原化合物与标志物（cAMP）的比值在dISF中为9.9倍，而皮肤活检中为4.4倍。

在经过胶带剥离处理的皮肤中，通过皮肤打孔活检或dOFM测量的LEO 29102的总皮肤浓度明显高于LEO 39652（约高70倍），在相同剂量的局部应用后得出此结果（见图5）。

本研究探讨了两种外用PDE4抑制剂(LEO 29102和LEO 39652)存在临床疗效差异的原因，这两种药物在传统皮肤活检中具有相似的药效和相似的皮肤暴露。从使用dOFM测量的两种PDE4抑制剂皮肤浓度数据可知，LEO 29102显示出cAMP水平升高，而LEO 39652未显示靶点结合的证据。在屏障受损的皮肤中，LEO 29102的dISF浓度为2100 nM，而LEO 39652仅为33 nM。对于两种化合物，在皮肤活检样本中测得的浓度比在dISF中的浓度高7至33倍。我们可以得出结论，LEO 39652在AD患者中缺乏临床疗效可能与皮肤作用部位LEO 39652浓度过低有关。低皮肤暴露是由于相对较差的皮肤渗透和高皮肤代谢的共同作用，导致皮肤中化合物的快速清除。

该研究很好地说明了dOFM可以作为测量相关皮肤层、真皮间质液中药物浓度的替代方法。使用dOFM测量皮肤dISF中的总药物浓度，不会受到皮肤表面残留制剂污染的风险，并且样品制备简单。dOFM方法适用于建立PK/PD关系，并可用于预测局部候选药物的疗效。一些研究还表明，dOFM是研究皮肤生物利用度和生物等效性的可靠方法。除此之外，在建立PK/PD关系或将皮肤PK数据与药物效力相关联时，应谨慎使用皮肤穿刺活检数据。

OFM开放式微灌流——质谱前端活体采样微灌流技术

奥地利JOANNEUM RESEARCH公司正在与美国食品和药物管理局（FDA）合作，建立一种评估外用制剂生物等效性的新方法。

可用于小分子/大分子药物，亲水/亲脂性物质，多肽，蛋白，抗体，结合药物与游离药物，转运体，酶，纳米载体和囊泡等的取样，同时分别检测PK与PD；

可以通过OFM直接在目标组织对所要分析化合物进行取样，然后进行随后的质谱检测，取样时间可长达48小时。

技术类型：

• 皮肤开放式微灌流 dOFM
• 脂肪开放式微灌流 aOFM
• 脑部开放式微灌流 cOFM