干货满满！5%阿昔洛韦乳膏IVRT方法的确认与验证全过程

活性药物成分（API或药物）从剂型中的释放对于局部半固体皮肤药物制剂至关重要，因为API必须先释放出来，才能扩散进入皮肤并在皮肤中被生物利用。通过使用垂直扩散池（VDC）和合成膜进行体外释放试验（IVRT），可以评估半固体药物制剂中API的释放速率（Al-Ghabeish等，2015；Dong等，2015；Krishnaiah等，2014；Shah等，2015；美国FDA，1997；USP，2011；Yacobi等，2014）。尽管IVRT测得的释放速率可能无法反映药物在体内递送的实际速率，但IVRT能够检测由于配方变化或药物产品的多种物理化学特性差异而导致的释放速率变化。经过验证的IVRT方法可以区分半固体药物产品中细微变化引起的原料药释放速率不同，这些变化可能会影响药物在体内的性能。因此，当两个产品批次（例如）的释放速率通过经过验证的IVRT方法确定为等效时，它降低了产品批次之间可能存在差异的风险。

美国食品和药物管理局（U.S.FDA）建议使用IVRT来评估某些批准后变更的药品一致性，例如生产场所或工艺变更，药品成分和组成的变更，或批量大小的变更（U.S. FDA, 1997）。最近，FDA还建议使用IVRT来支持阿昔洛韦软膏（U.S.FDA, 2012年阿昔洛韦软膏特定产品指导草案）、苯甲醇乳液（U.S.FDA, 2014年苯甲醇特定产品指导草案）和阿昔洛韦乳膏（U.S.FDA, 2016年阿昔洛韦乳膏特定产品指导草案）等药物的生物等效性（BE）评估。该IVRT方法的应用涉及测试产品与参比上市药物（RLD）产品的比较。IVRT方法已被美国药典（USP）确立为药典检测方法。USP通则<1724>中描述了此性能测试的标准化装置、程序以及用于评估此类产品一致性的统计方法。一般情况下，按照USP标准方法，IVRT研究需要使用六个扩散池分别比较参比产品（R）和测试产品（T）的API释放速率。如果比较结果未满足USP<1724>中描述的一致性统计标准，则可进行第二阶段测试，为每组T和R产品增加12个扩散池。然后应用统计检验比较18个扩散池每种T和R产品的释放速率。

大量研究表明，任何IVRT方法参数的变化都可能影响IVRT结果（Klein, 2013; Lusina Kregar等，2015; Ng等，2012, 2005; Sesto Cabral等，2014; Shah等，1999）。这些研究共同证明，表征每个可能改变测试结果的IVRT参数的影响至关重要，同时需要验证在IVRT保持一致和可靠的情况下其操作范围。Thakkar和Chern（2003）描述的IVRT方法开发、优化和验证的系统化方法代表了十多年来的行业标准。尽管关于IVRT方法优化或验证的单个参数探索已在文献中讨论，但对于IVRT验证的整体方法直到当前工作才取得有意义的进展。事实上，据我们所知，目前尚未在已发表的文献中描述任何标准化方法，用于对所有相关IVRT方法参数进行全面验证，包括测试系统的所有关键组件、预先设定的目标验证标准以及相关的接受标准和规范。因此，本研究的主要目的是采用更全面的方法，对5%阿昔洛韦乳膏的IVRT方法进行确认和验证，以解决重要的确认/验证问题。该方法基于Sam G. Raney、Paul a . Lehman和Thomas J. Franz （个人通信）开发的验证协议和相关验证概念（例如，如何确定IVRT识别的敏感性、选择性、特异性或回收率）。

本研究的具体目的是对可能会影响IVRT方法性能的设备（即VDC）操作参数进行全面表征，并系统地确认和/或验证以下内容的操作范围：IVRT设备、执行测试的实验室、阿昔洛韦的HPLC-UV样品分析方法，以及5%阿昔洛韦乳膏的IVRT方法，从而确保这些要素共同能够产生有效的结果。

对于IVRT设备的确认，VDC的操作参数（如接收室体积、孔径、温控、搅拌速度、取样精度以及环境条件）均根据预定的操作规范进行了评估和确认。为确认执行IVRT方法的实验室能力，使用氢化可的松乳膏进行了一项IVRT研究，以评估实验内和实验间的变异性。采用USP <1724>中描述的统计方法评估产品一致性（等效性），以确定在比较氢化可的松乳膏自身释放速率时，是否能准确确定测试产品（T）与参比产品（R）比较的等效性，从而确认该实验室适合进行有效的测试。此外，根据ICH指南完成了阿昔洛韦的HPLC-UV样品分析方法的验证，包括特异性、选择性、线性、准确性、精密度、耐用性、稳定性以及定量下限和上限的验证（验证了HPLC方法的灵敏度和范围）。

1%（w/w）氢化可的松乳膏（Lycor™；Micro Labs Limited，印度班加罗尔）被用作实验室确认的测试产品。含40%水的两亲性乳膏基质（Ultraphil®；Bayer，奥地利维也纳）被用作HPLC-UV方法验证的阴性对照剂乳膏。5%阿昔洛韦乳膏（Zovirax®；GlaxoSmithKline，奥地利维也纳）作为IVRT方法验证的参比阿昔洛韦乳膏产品；另外，包含2.5%、5.0%和10.0%阿昔洛韦的三种特制乳膏配方仅用于灵敏度、特异性和选择性测试。在每次产品配对比较中，被指定为 R 或 T 的产品取决于所参与比较的具体产品。

2.2 VDC系统

通过在接收室的介质更换口注入一部分预热的接收介质，从而排出等量的接收介质样品到取样口，完成接收介质的采样。采样时，将六个 2 mL 注射器（InjektLuer，B.Braun，德国 Melsungen）通过延长管组件（E87-P，Codan，德国 Lensahn）、旋塞阀（四通旋塞阀，2 个母 Luer 锁接头，带旋锁的公 Luer 接头，Qosina，美国纽约）、单向阀（常闭单向阀，母 Luer 锁接头，Qosina，美国纽约）以及 Luer 锁连接器（母对母 Luer 锁接头，Qosina，美国纽约）连接到每个 VDC 的介质更换口。整个操作使用六通道注射泵（AL-1800，WPI，德国柏林）完成。采样时，将一个剂量针（F560085-45-L，Vieweg，德国 Kranzberg）连接到采样口，用于收集接收介质样品，并将样品直接转移至锥形管（Protein LoBind Tubes 0.5 mL，Eppendorf，德国汉堡）。然后，通过带紫外检测的 HPLC 方法分析接收介质样品中的氢化可的松或阿昔洛韦的浓度。

用于测定阿昔洛韦乳膏中阿昔洛韦释放速率的 IVRT 方法此前已由 Nallagundla 等人开发并描述（Nallagundla et al., 2014）。该 IVRT 方法采用 Tuffryn 膜（直径 25 mm，孔径 0.45 μm，PALL Corporation，美国密歇根州）以及由氯化钠溶液（0.9% NaCl 溶液，Fresenius，奥地利格拉茨）组成的接收介质。用于实验室验证的氢化可的松乳膏的 IVRT 方法同样使用了 Tuffryn 膜，接收介质由 70% 水和 30% 乙醇（Sigma-Aldrich，德国 Steinheim）组成。

每次IVRT运行时，6个VDC并行操作。在600 rpm转速下搅拌接收介质，膜温度保持在32±1℃。VDC系统平衡约30分钟。将300毫克的乳膏涂在Tuffryn膜上，该膜在接收介质中需预先浸泡30分钟。在使用阿昔洛韦乳膏后0.5、1、2、3、4、5和6小时，或在使用氢化可的松乳膏后0.5、1、2、3、4和6小时，同时从6个VDC中收集相应接收介质的样品。用500µL相应的接收介质(流速为2 mL/分钟)冲洗采样口，并收集样品。 

根据测量的阿昔洛韦或氢化可的松浓度，用Higuchi方程(Takeru Higuchi, 1961)计算释放速率: 

                                公式1

式1中，Q[µg/cm²]为单位暴露面积释放的药物量，t[min]为时间，D [m²/s]为扩散系数，C_s[µg/cm³]为药物在制剂中的溶解度，A[µg/cm³]为产品中的初始药物浓度。Higuchi方程基于几个假设，比如完美的漏槽条件等。D和A都是常数，其中A高于C_s(Siepmann and Peppas, 2011)。

                       公式2

Q_n[µg/cm²]表示采样时间n时单位面积内的药物释放量，C_n[µg/cm³]为采样时间n时的样品浓度，V_s [cm³]为样品体积，V_c [cm³]为VDC的体积，A_c [cm²]为VDC的孔口面积。将 Q_n对时间平方根 (√t)作图后，其回归线的斜率即为释放速率。

Q_n受样本体积、VDC（垂直扩散池）体积以及VDC孔口直径的影响。因此，在设备确认期间验证了这些参数的尺寸。为了测量阿昔洛韦从乳膏中的释放速率，必须验证两个前提假设：一是膜不应成为速率限制因素，二是接收介质应为阿昔洛韦提供足够的漏槽条件。因此，相对于IVRT期间接收介质中的API浓度，接收介质应该为API提供过量的溶解度。为了验证IVRT方法的参数，对阿昔洛韦在接收介质中的溶解度以及膜的惰性进行了评估。尽管不同批次的Tuffryn膜之间以及同一批次中不同膜之间可能存在细微的变化，但假设这种变化不会对IVRT方法的性能产生关键影响，因为膜应该是惰性的，不与API结合，也不限制释放速率。因此，对不同批次膜的评估不在本研究范围内，尽管将其纳入IVRT方法更广泛和更全面的表征中可能具有一定的价值。

2.4  IVRT设备确认

在IVRT设备确认期间，对VDC的所有关键设备参数进行了评估，包括接收室容量和VDC孔径、VDC系统（及膜）的温控能力、搅拌速度、分配的取样体积以及环境条件。为计算Q_n（公式2），分别通过重量和长度测量确定了每个VDC的接收室容量和孔口直径。为了评估每个VDC的接收室容量，将搅拌棒和转子放入VDC中，并在VDC装满纯水后记录重量增加值。孔径直径使用游标卡尺测量。膜表面的温度保持在32 ± 1°C，以避免因温度变化引起扩散系数（D）的改变。在所有六个VDC中，接收介质的温度使用校准过的温度计（Testo 177-T3，Testo Ges.m.b.H，奥地利）进行测量，测量前将VDC装满纯水并平衡30分钟。为了确定膜表面的温度，六个VDC被装满纯水，每个VDC夹入一个预浸泡的Tuffryn膜（直径25 mm，孔径0.45 μm，PALL Corporation，美国密歇根州），平衡20分钟后，使用非接触式红外温度计（TDT8806，Thomson HC，法国）进行测量。

用磁力搅拌器持续搅拌接收介质。通过使用光学转速计（Testo 177-T3, Testo Ges.m.b.H，奥地利）评估磁性叶轮的搅拌速率，验证了每个和所有六个VDC中搅拌速度的一致性。在扩散池中放置有反光带标记的搅拌棒，在600 rpm的转速下验证搅拌速度。

实验中使用了一台六通道注射泵，以确保同时且一致的取样。通过重量测定评估六通道泵的分配体积：以2 mL/min的流速使用六个2 mL注射器将500 μL的纯水泵入小瓶中。

所有物理参数均进行三次测量，并计算平均值和变异范围（V），以根据预定义的接受标准（表1）确定六个VDC的准确性和扩散池间变异性。这些设备确认的接受标准是基于USP通则<725>（USP，2009）中描述的VDC系统的性能验证测试（PVT）以及USP通则<1724>（USP，2011）中描述的IVRT程序制定的。

表1: 预定义设备验收标准和结果

此外，还评估了工作环境，包括工作台的水平度、设备顶部与任何冷却通风口的自由距离以及是否暴露在直射阳光下。工作台水平度使用数字水平仪在两个方向上进行测量，确保倾斜度小于±1°。按照VDC系统要求，确保顶部有76 cm的自由距离。还特别注意确保VDC不暴露于直射阳光下，也不直接暴露于冷却通风口。

实验室执行IVRT的能力通过使用氢化可的松乳膏进行性能验证测试（PVT）来确认，基于USP通则<725>“局部和透皮药物制剂——产品性能测试”（USP，2009）中描述的方法，并按照USP通则<1724>（USP，2011）中规定的程序进行。每次实验在六个VDC中分别应用300毫克氢化可的松乳膏，实验进行两次，分别在两天内由同一操作人员完成。实验设置搅拌速度为600 rpm，膜的温度为32 ± 1°C。接收介质样本中的氢化可的松浓度通过HPLC-UV（Summit, Dionex, Sunnyvale, CA, USA）在247 nm处测定。色谱分离使用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（3×100 mm, 3.5 μM，Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA），流动相为25%的乙腈（≥ 99.9%，Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA），流速为800 μL/min，柱温保持在30°C，进样体积为10 μL。

表2: 实验室确认测试(PVT)的预定义的验收标准和结果

阿昔洛韦样本通过HPLC-UV在280 nm波长下进行分析。阿昔洛韦通过Acquity T3色谱柱（2.1 x 75 mm，1.8 μm，Waters，Milford，MA，USA）在400 μL/min的流速下洗脱，使用含7%甲醇的水相流动相（等温条件），温度为25°C，进样体积为1 μL。阿昔洛韦的单独储备溶液在DMSO（≥ 99.99% USP参比标准，Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄）中配制，用于建立校准曲线（1 mg/mL）以及质量控制样本（QCs）的制备（0.8 mg/mL）。两种储备溶液的分装样本在-80°C存储直至分析。将储备溶液在氯化钠溶液（接收介质，NaCl 0.9%溶液）中进一步稀释，得到浓度为5、10、50、100和500 μg/mL（校准标准）以及15、200和400 μg/mL（QC样本）的样品。在IVRT实验结束后，收集的样品被转移到0.5 mL HPLC聚丙烯瓶（Eppendorf，德国汉堡）中，并存储于-80°C。在分析之前，校准标准、QCs和IVRT样本在室温下解冻约20分钟，涡旋混匀后立即分析。在每个分析批次运行中，注射五个校准标准和一个空白样本，分别在批次开始时和结束时注射一次。根据两组标准标准建立回归曲线。每批至少注射3个QC样本，并且每20个样本后重新分析所有三个QC样本。HPLC-UV方法根据ICH指南（ICH，2005）进行了验证，验证内容包括特异性、选择性、线性、准确性、精密度、定量下限（LLOQ）、检出限（LOD）、耐用性和稳定性。HPLC验证的接受标准总结见表3。

2.6.1 特异性和选择性

制备四种对照基质/溶液并进行三次重复分析。第一种对照基质/溶液为不含阿昔洛韦的空白接收液（0.9%氯化钠溶液），作为阴性对照 C_n；第二种为加入阿昔洛韦（250 μg/mL）的同种接收液，作为阳性对照 C_p。使用阴性对照剂乳膏(Ultraphil^®两亲性乳膏载体，40%水)作为基质阴性对照(C_nm)进行IVRT运行，以研究可能由阴性对照剂乳膏成分产生的干扰峰的可能性。随后，将上述实验中的样品加入阿昔洛韦(250µg/mL)作为基质阳性对照(C_pm)，以确保IVRT运行的阿昔洛韦峰的完整性不受影响。

使用C_p的平均保留时间()和C_pm的平均保留时间()来定义阿昔洛韦保留时间的接受标准，即相对于标称保留时间的差异不应超过10%。此外，对阴性对照(C_n，C_nm)进行分析，以验证在指定的保留时间内没有可检测的阿昔洛韦浓度，从而满足预定的接受标准，确保方法的选择性和特异性。

2.6.2 线性关系

为了测试线性关系，制备了一组五个校准标准，浓度分别为5（C₅）、10（C₄）、50（C₃）、100（C₂）和500（C₁）μg/mL，溶解在氯化钠溶液（接收介质）中，并在三次批次实验中进行测量，每次实验分别在开始和结束时各测量一次（n = 30）。对于每次批次实验，使用该批次中两组校准标准曲线的测量结果建立线性回归曲线。验证的预定规范要求：75%的标准品，并且每个浓度至少有一个标准品，应满足以下接受标准：测量浓度C_{meas, lin}应在标称浓度C_nom的±15%范围内，最低浓度C₁应在C_nom的±20%范围内。此外，计算得出的每批次回归曲线的R²值应大于0.95。

2.6.3 准确度、精密度和耐用性

为了测试准确度、精密度和耐用性，将阴性对照剂乳膏组的IVRT样品加入浓度为400(S₄₀₀)、200(S₂₀₀)和15µg/mL(S₁₅)的阿昔洛韦，并作为准确性标准。这三种精度标准溶液分别在三个批次运行中进行分析和处理，并进行三次测量。第三批运行由另一位分析员在不同的日期进行，并且将柱温设为30°C（而不是25°C）来评估精度和耐用性。

为了验证准确性，前两次批次实验中每种溶液（每种溶液分析三次）的平均测量值()与各自标称浓度（S_nom）的偏差对于溶液 S₂₀₀ 和 S₄₀₀ 不应超过 ±15%，对于溶液 S₁₅ 不应超过 ±20%。

为了验证精度和耐用性，通过计算每三个批次实验的批内CV和批间CV来评估批内和批间运行精度(表3)。预先确定的接受标准是S₄₀₀和S₂₀₀的CV应小于15%，S₁₅的CV小于20%_。

2.6.4 稳定性

对于稳定性验证，使用溶液 S₄₀₀ 和 S₁₅ 分别测试以下条件下的稳定性：

• 长期稳定性：在-80°C 和 -20°C 下储存 97 天；

• 短期稳定性：室温下储存 32 小时；

• 高温稳定性：在35°C 下储存 6.5 小时；

• 冻融稳定性：研究了三次冻融循环，第一个循环在 -20°C 储存后进行，另外两个循环在 -80°C 储存后进行。此实验旨在验证温度条件对典型 IVRT 实验的适用性，其中样品在 IVRT 实验期间存储于 -20°C，实验结束后转移至 -80°C 存储。

此外，还测试了校准标准 C₅（5 μg/mL）、C₃（50 μg/mL）和 C₁（500 μg/mL）在 -80°C 下储存 8 个月的长期稳定性。所有测量均进行三次重复处理和分析。

稳定性判定标准：如果溶液或校准标准的平均测量浓度相对于其标称浓度（S_nom, C_nom）的偏差不超过 ±15%，则认为 S₄₀₀、C₁ 和 C₃ 样品的稳定性可接受。而对于最低浓度样品（C₅、S₁₅），偏差不超过 ±20% 则认为稳定性可接受。

2.6.5 定量下限和检出限

通过使用最低校准标准  C₅的准确性和精密度实验数据集（n = 6），并借助仪器软件（Openlab EZChrom）计算信噪比（S/N），确定了定量下限（LLOQ）和检测下限（LOD）。计算了这六个 S/N 比值的平均值、理论检测下限（S/N ≥ 3）和理论定量下限（S/N ≥ 10）。

通过评估膜的惰性、阿昔洛韦在接收介质中的溶解度，以及使用IVRT方法测得的乳膏中阿昔洛韦释放速率的线性、精密度、可重复性、灵敏度、特异性、选择性和耐用性，对5%阿昔洛韦乳膏参比产品的IVRT方法进行了验证。此外，还计算了回收率。预定义的接受标准列于表4中。

2.7.1 API在接收介质中的膜惰性和溶解度

IVRT方法使用Tuffryn膜和0.9%氯化钠溶液作为接收介质。通过将三种膜分别浸泡在10 mL相同测试溶液（35μg/mL阿昔洛韦溶于0.9%氯化钠溶液）中，在32 ±1°C下持续6小时，研究阿昔洛韦与Tuffryn膜的结合情况。作为对照，制备三份相同的测试溶液但不浸泡膜，同样在32 ±1°C下平衡6小时。随后，测定六份测试溶液的浓度，通过将浸泡膜的溶液平均浓度除以对照溶液的平均浓度，计算相对于对照的回收率。通过将阿昔洛韦溶解在接收介质中制备饱和溶液，来评估阿昔洛韦在接收介质中的溶解度，重复进行三次实验。以600 rpm搅拌5.5小时，并在32 ±1°C下静置过夜，获得均匀溶液。取上清液样品，过滤（Nalgene针式过滤器，0.2 μm，25 mm，SFCA膜，Nalgene，Thermo Scientific），稀释后分析，测定溶解的阿昔洛韦浓度。 

2.7.2 线性、精密度、重复性

进行了三次IVRT实验，每次实验使用一组6个VDC，并在三天内分别使用5%阿昔洛韦乳膏参比产品，以表征IVRT方法的线性、精密度和重复性。通过SAS软件中的PROC REG程序（SAS Institute, 1999）进行线性回归计算每个IVRT实验中每个VDC的释放速率，共得到18个释放速率。如果阿昔洛韦的释放符合Higuchi方程，则单位面积释放的药物量应与时间平方根呈线性关系。可接受线性的标准为决定系数（R²）大于0.9。

为了确定精密度和可重复性，使用随机效应模型估算释放速率的实验内和实验间变异性。通过随机效应模型估算的平均释放速率（μ）和方差分量（𝜎₁²- 实验间变异性，𝜎₂² - 实验内变异性），计算变异系数（CV）。实验中将三次实验结果作为随机效应变量。如果CV小于15%，则认为精密度和重复性可接受。

2.7.3 灵敏度、特异性和选择性

通过研究三种阿昔洛韦测试乳膏（分别含有2.5%、5.0%和10.0%阿昔洛韦）的释放速率来评估灵敏度、特异性和选择性。通过评估乳膏中阿昔洛韦浓度变化对阿昔洛韦释放速率的影响，验证IVRT方法的灵敏度。如果2.5%阿昔洛韦测试乳膏的平均释放速率低于5.0%阿昔洛韦测试乳膏，而10.0%阿昔洛韦测试乳膏的平均释放速率高于5.0%阿昔洛韦测试乳膏，则认为IVRT方法具有灵敏度。

IVRT方法的特异性是通过评估阿昔洛韦释放速率的响应性（即变化）是否与阿昔洛韦测试乳膏的阿昔洛韦浓度（即2.5%、5.0%或10.0%）成比例来表征。采用线性回归模型，以释放速率为因变量，阿昔洛韦浓度为自变量，估算决定系数（R²）。如果R²大于0.9，则认为IVRT方法具有特异性，确认了释放速率与浓度之间的特定比例线性关系。

通过USP通则<1724>（USP, 2011）中描述的产品一致性检验统计方法，验证了 IVRT 方法对区分低浓度和高浓度阿昔洛韦测试乳膏（即分别含 2.5% 和 10.0% 阿昔洛韦）与 5.0% 阿昔洛韦测试乳膏释放速率不等效的选择性。在统计分析中，5.0%阿昔洛韦测试乳膏（n = 6）被指定为参比产品（R），而2.5%或10.0%阿昔洛韦测试乳膏（n = 6）被指定为测试产品（T）。如果R与T的两组两两比较中，90%置信区间均落在75.00%和133.33%的范围之外，则认为IVRT方法具有足够的选择性，可区分不同浓度乳膏的释放速率在统计学上具有显著差异。以类似方式，IVRT 方法通过对照比较，验证了其能够准确识别 5.0% 阿昔洛韦乳膏参比品（在不同 IVRT 实验中重复测试，n = 6）的释放速率与自身等效。在线性、精密度和重复性测试中进行的三次 IVRT 实验的两两比较中，如果每个（R vs. R）对比的 90% 置信区间均落在 75.00% 和 133.33% 的范围内，则认为 IVRT 方法是准确且具有适当选择性的。

2.7.4 耐用性

为了验证IVRT方法的耐用性，对方法参数(包括温度和接收介质混合速率)进行了四次IVRT试验(每次n = 6 VDC)，每次试验对方法参数(包括温度和接收介质混合速率)有轻微的扰动。相对于标称温度32°C(32±1°C)和标称搅拌速率600 rpm，使用5%阿昔洛韦乳膏作参比，评估了两种温度变化(即-2°C和+2°C)和两种混合速率变化(即- 60 rpm和+ 60 rpm)。如果相应IVRT实验的平均释放速率与3次IVRT实验中18个VDC的平均释放速率偏差不超过15%，则认为IVRT方法对方法参数的变化具有耐用性。

2.7.5 回收率

阿昔洛韦的HPLC-UV方法验证包括特异性、选择性、线性、准确度、精密度、耐用性和稳定性验证，以及LLOQ和LOD的确定。HPLC-UV法通过了验证和预先设定的接受标准，结果如表3所示。

平均保留时间(1.831min)和 (1.831min)没有差异，阴性对照(C_n)没有检测到药物浓度。从而验证了IVRT样本分析方法的选择性和特异性。线性分析结果显示，24个C₁-C₄标准品中有23个标准品标称浓度偏差小于15%，6个C₅标准品中有5个标准品偏差小于20%;三条回归线的计算R²值分别为1.00、0.99和0.99。结果表明，HPLC具有较好的线性关系。

该方法的准确性已验证，证据表明两个较高浓度水平（S₄₀₀ 和 S₂₀₀）的平均浓度（）与其标称浓度的偏差仅为 7%，而最低浓度水平（S₁₅）的平均浓度与标称浓度的偏差仅为 10%。精密度标准也得到了满足，其中批内变异系数（CV）在 1%-4% 之间，批间变异系数低于 3%。无论是操作员、柱温还是处理日期的变化，该方法均表现出稳健的结果。结果表明，长期稳定性、短期稳定性以及冻融循环均在接受标准范围内，并通过了验证。理论定量下限（LLOQ）为 2.27 μg/mL，理论检测下限（LOD）为 0.68 μg/mL。所有测量将 5 μg/mL（最低校准标准）定义为实际的定量下限（LLOQ）。

所选阴性对照剂乳膏Ultraphil®的一个局限性是，其成分可能与参比阿昔洛韦乳膏(Zovirax®^®，GlaxoSmithKline, Vienna, Austria)不完全相同。为了准确实施，测试产品的阴性对照剂配方更为理想。

采用5%阿昔洛韦对照乳膏和2.5%、5.0%和10.0%阿昔洛韦对照乳膏进行IVRT验证。评估膜惰性，以及阿昔洛韦在接收介质中的溶解度，并验证IVRT方法的线性、精密度、重现性、灵敏度、特异性、选择性、耐用性和回收率。接受标准和结果如表4所示。

注意，许多配方可以通过IVRT方法识别为等效，尽管这些配方的组成可能不同。

3.4.1 原料药在接收介质中的膜惰性和溶解度

测定的阿昔洛韦在生理盐水中的溶解度为1937.29µg/mL (SD: 46.31µg/mL)，比方法验证实验中得到的样品中最高测定浓度(95µg/mL)高出20倍以上。该溶解度与先前发表的数据相当，其中发现阿昔洛韦在37°C水中的溶解度为2.5±0.1 mg/mL (Shishu et al.， 2009)。这些结果证实，阿昔洛韦在接收介质中的溶解度足够高，可以确保漏槽条件。回收率为105.51%，没有证据表明阿昔洛韦与膜有明显的结合，因此证实了膜的惰性。由此，可以得出结论，该膜不存在阿昔洛韦扩散的限速屏障。

3.4.2 线性、精密度和重现性

用参比阿昔洛韦乳膏(每次IVRT实验，6个VDC的膜上各涂5%)三次评价阿昔洛韦释放速率的线性、精密度和重现性。18个单独的药物释放速率均表现出明显的线性关系，R²均大于0.97。这些结果表明，Q与时间的平方根之间存在线性关系。图1显示了在六个VDC上三次给药的平均阿昔洛韦释放速率。实验1、2和3的平均释放速率分别为272.35 (SD 16.79)、272.60 (SD 10.43)和244.73 (SD 4.01) mg/cm²/h^1/2。

图1. 使用参比5%阿昔洛韦乳膏的三次IVRT的释放速率（每次IVRT运行6次vdc的平均数据）

为了确定精密度和重现性，使用随机效应模型估计变异性参数。它们分别为𝜎₁² = 233.96，𝜎₂²= 135.61，µ= 263.23µg/cm²/h^1/2，导致批间变异的CV为5.81%，批内变异的CV为4.42%。变异率小于15%，因此，该方法的精密度和重现性是可以接受的。

3.4.3 灵敏度、特异性和选择性

图2. 三种浓度分别为2.5%（红色）、5.0%（绿色）和10.0%（蓝色）的阿昔洛韦乳膏释放速率的箱图

采用线性回归模型，以释放速率为因变量，各试验产品的阿昔洛韦浓度为自变量，检验特异性。结果表明，乳膏中阿昔洛韦浓度与所得到的阿昔洛韦释放速率呈线性正比关系(R²= 0.943)。

为了评估选择性，通过将5.0%阿昔洛韦乳膏与2.5%和10.0%阿昔洛韦乳膏两两比较，测试IVRT方法准确识别不等效产品性能的能力。两种比较的计算置信区间均未落在75.00%和133.33%的范围内(表4)，因此证实了这些产品的不等效性，从而验证了IVRT方法的选择性。

为了验证IVRT方法能够准确地识别等效产品的性能，在使用5%阿昔洛韦乳膏作为参比的三个组之间进行了三次两两比较。结果显示，所有两两比较的计算下限和上限均落在75.00%和133.33%的置信区间范围内(表4)，证实了IVRT方法能够准确检测产品性能的一致性。结果表明，产品浓度与API释放速率之间存在线性关系。对于某些药品，释放速率不一定与产品浓度线性相关(Bottari et al.，1974)，上述参数在IVRT方法验证中可能不通过，但在本例中通过了。

本研究中使用的2.5%、5%和10%的阿昔洛韦乳膏，充分促进了在一个范围内对释放速率的敏感性和特异性的评估，该范围包括并超过了根据美国FDA 2016年《阿昔洛韦乳膏产品专用指南草案》规定使用2.5%、5%和7.5%阿昔洛韦乳膏所涵盖的范围。2.5% - 10%阿昔洛韦的浓度范围也充分促进了对该方法选择性的评价。不可否认，7.5%的阿昔洛韦乳膏的释放速率会低于10%阿昔洛韦乳膏的释放速率，并且更接近参比浓度配方的释放速率。这样，制备7.5%的阿昔洛韦乳膏比使用10%的阿昔洛韦乳膏提供了更具挑战性的测试来评估IVRT方法的选择性。从本验证中无法直接得出IVRT方法是否具有足够的区分能力，从而发现7.5%配方的阿昔洛韦乳膏的释放速率与参比5%浓度配方的释放速率不相等。然而，由于IVRT方法能够区分2.5%阿昔洛韦乳膏的释放速率与5%阿昔洛韦乳膏的释放速率不相等，并且由于IVRT方法的释放速率在整个评估范围内显示为合理的比例，同样大小(-2.5%)的浓度差异，相反方向(+2.5%)也会被区分为不相等，这并不是不合理的。 

3.4.4 耐用性

（A）

（B）

图3. (A)在接收介质/膜温度分别为34°C（蓝色方块）、32°C（黑色圆点）和30°C（红色三角形）的条件下，参比5%阿昔洛韦乳膏的释放速率曲线。(B)在640 rpm（蓝色方块），600 rpm（黑色圆点）和560 rpm（红色三角形）的搅拌速度下进行的三次IVRT运行中，参比5%阿昔洛韦乳膏的释放速率曲线。

表5:不同接收介质/膜温度和不同搅拌速率下的计算释放速率(平均值、最小值、最大值、中位数和标准差)[µg/cm²/h^1/2]

3.4.5 回收率

回收率分三次进行评估。在每次运行中，将5%的参比阿昔洛韦乳膏涂抹在6种VDC的膜上。三次IVRT的计算回收率(及相应的剂量消耗)分别为8.39%、7.66%和6.90%。一方面，由于回收率小于30.00%(见表4)，另一方面，由于在整个IVRT研究期间，阿昔洛韦的释放速率具有可接受的线性，因此阿昔洛韦的剂量消耗程度被认为是可接受的。

对IVRT法的操作参数进行了综合表征，并对5%阿昔洛韦乳膏的IVRT方法进行了确认验证。结果证实了IVRT法测量外用乳膏中阿昔洛韦释放速率的潜在适用性。尽管已发表的文献中描述了各种验证IVRT方法的尝试，但明显缺乏全面的确认/验证方法。据我们所知，这项工作是科学文献中首次报道的，它设想并说明了与IVRT方法相关的许多基本验证概念如何被组织成IVRT验证的综合方法。我们的工作是在FDA阿昔洛韦乳膏指南草案发布之前进行的，该草案包括与IVRT验证相关的详细信息(美国FDA，阿昔洛韦乳膏产品特定指南草案，2016)。该指南中描述的方法与本工作中描述的方法之间存在显着差异。特别是，该指南中信息的范围主要涉及IVRT方法开发和方法验证，包括可能与我们使用的数据分析技术不同的结果分析的接受标准和/或技术。我们的工作范围不包括IVRT方法开发，但确实包括FDA指南中提到但未明确描述的其他部分，如扩散池设备确认的具体方法和详细程序，实验室确认，以及我们的HPLC分析方法的验证。因此，我们的工作与随后发布的FDA指南之间的主要对齐领域与验证IVRT方法本身有关。在随后发布的FDA指南中描述的许多基本验证概念都在我们IVRT验证的系统方法中得到了解决，尽管我们采用的具体方法，我们设定的规范，我们所做的分析可能与我们希望在不久的将来建立的全面和标准化的IVRT验证方法所能接受的方法有所不同。

本文章翻译自以下文献，仅供参考：

Tiffner KI, Kanfer I, Augustin T, Raml R, Raney SG, Sinner F. A comprehensive approach to qualify and validate the essential parameters of an in vitro release test (IVRT) method for acyclovir cream, 5. Int J Pharm. 2018 Jan 15;535(1-2):217-227. doi: 10.1016/j.ijpharm.2017.09.049.